蛋白激酶將磷酸基團從ATP轉移到蛋白多肽底物上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，直接影響目標的活性和功能。放射性研究表明，真核細胞中大約30%的蛋白經(jīng)過磷酸化修飾。這一關鍵的翻譯后修飾調控了廣泛的細胞活性，包括細胞周期 、分化、代謝和神經(jīng)元通訊。此外，異常的磷酸化事件與許多疾病狀態(tài)相關。在評估磷酸化時，選擇的方法可能會有所不同，這取決于多個因素，包括提出的具體問題以及特殊儀器或試劑的可用性。如何檢測蛋白磷酸化，本文簡要介紹了幾種常用方法，并提出了每種方法的優(yōu)點和缺點。

激酶活性分析

蛋白激酶通常是多個信號轉導網(wǎng)絡的常見組分，它們影響了眾多負責生物反應的下游效應物，因此，評估某個特定激酶的活性可能為平行通路 提供寶貴信息。生物學樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報告系統(tǒng)來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。此外，R&D Systems還提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能夠定量任何可產(chǎn)生ADP的激酶的活性。盡管我們能夠獲得有關特定激酶行為的信息，但評估細胞提取物中的酶活性僅僅揭開了信號通路的冰山一角。我們對蛋白如何被修飾還知之甚少，且體外活性分析也不能說明內(nèi)源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測可能為細胞如何應對外界刺激提供更詳細的分析，因為磷酸化肽段的鑒定為蛋白的表達和功能狀態(tài)提供信息。

磷酸化特異抗體的開發(fā)

直接測定蛋白磷酸化的一種經(jīng)典方法是將整個細胞與放射性標記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細胞提取物，通過SDS-PAGE分離，并曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統(tǒng)方法包括2D凝膠電泳 ，這種技術假定磷酸化會改變蛋白的遷移率和等電點。

鑒于這些方法很費力，磷酸化依賴抗體的開發(fā)受到研究人員的極大歡迎。1981年，*個有記錄的磷酸化抗體在兔子中產(chǎn)生，使用的是鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸結合物。這一抗體廣泛地識別了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成的磷酸化肽段來免疫兔子，開發(fā)出多個磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標蛋白磷酸化位點周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑 。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)方法的改進以及新的免疫分析技術的開發(fā)打開了大門。在任何技術中使用磷酸化特異抗體的忠告是，成功的檢測依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。

western blot

Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的zui常用方法，大部分細胞生物學實驗室都擁有開展這些實驗的設備。利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨后轉移到膜上(通常是PVDF或尼龍膜)，之后利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。典型的Western blot實驗步驟避免了使用放射性同位素時的危險品和廢物處理要求。許多磷酸化特異抗體十分靈敏，可輕松檢測常規(guī)樣品(如10-30 µg細胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個抗體來檢測同源蛋白的總水平(而不考慮磷酸化狀態(tài))，以確定磷酸化組分相對于總組分的比例，并充當上樣內(nèi)對照?；瘜W發(fā)光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來提供蛋白分子量的信息。

酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)

ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優(yōu)于Western blot，且在調節(jié)激酶活性和功能的研究中表現(xiàn)出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態(tài)無關。隨后讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復雜的異質樣品(如細胞裂解液)中的一個組分。加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號強度與zui初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統(tǒng)的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術具有一些優(yōu)點。首先，利用經(jīng)過校準的標準品，可輕松定量結果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個抗體，帶來了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測低豐度的蛋白。zui后，微孔板形式的通量比傳統(tǒng)的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來了激酶活性的間接測定。不過，另一類ELISA技術使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方法，帶來激酶活性的更直接測定。

基于細胞的ELISA

盡管體外生物化學激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假說檢驗和藥物篩選，但它們無法復制細胞內(nèi)的環(huán)境。分析完整細胞內(nèi)的蛋白磷酸化也許能更準確地代表特定信號通路網(wǎng)絡的狀態(tài)。一些免疫分析zui近被開發(fā)出來，能夠在完整細胞的背景下測定蛋白磷酸化。細胞在同一個孔中被刺激、固定和阻斷。使用磷酸化特異抗體，利用熒光或顯色檢測系統(tǒng)來評估磷酸化狀態(tài)。此外，在微孔板的同一個孔中同時檢測磷酸化蛋白和總蛋白。因此，來自目的蛋白的信號可通過第二種蛋白來標準化，校正各孔之間的差異，實現(xiàn)磷酸化蛋白水平的準確評估，并比較多個樣品，與傳統(tǒng)免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過了制備細胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析。

細胞內(nèi)流式細胞術和ICC/IHC

傳統(tǒng)的細胞內(nèi)流式細胞術和免疫細胞化學/免疫組織化學(ICC/IHC)是檢測磷酸化事件的有力工具。流式細胞儀利用激光來激發(fā)用于抗體檢測的熒光染料。在評估同一個細胞中的多個蛋白時，必須精心選擇濾光片組合和熒光染料，其光譜不能重疊。流式細胞術很有優(yōu)勢，因其實現(xiàn)了快速、定量的單細胞分析。通過細胞表面標志的分型可檢測異質群體中特定細胞類型的蛋白，而無需在物理上分離細胞。通過這種方法可分析稀有的細胞群體，而不用擔心細胞損失或細胞分選過程中可能發(fā)生的蛋白表達變化。

ICC通常指的是利用顯微鏡對培養(yǎng)細胞中的蛋白進行檢測，而IHC指的是對完整組織切片中的蛋白進行檢測。與流式細胞術相似，這些技術實現(xiàn)了細胞或組織內(nèi)多個蛋白的評估，只是要足夠重視，避免熒光光譜或顏色的重疊。熒光和顯色檢測技術都經(jīng)常使用。與監(jiān)控磷酸化的其他形式不同，ICC通常是確定細胞內(nèi)定位的方法。流式細胞術和ICC/IHC都需要高親和力、高特異性的抗體、阻斷步驟、對照和抗體滴定，以避免因非特異性結合而帶來的不明確結果。

通過流式細胞術和ICC來檢測磷酸化蛋白要求蛋白是穩(wěn)定的，且抗體能夠接近。細胞通常經(jīng)過刺激，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交聯(lián)磷酸化蛋白，使其穩(wěn)定，便于分析。固定后的細胞必須經(jīng)過透化處理，讓磷酸化特異抗體可進入細胞。對于不同的亞細胞定位，通常使用不同的透化技術。溫和的去垢劑可實現(xiàn)細胞質蛋白的檢測，而抗體要想接近核蛋白，可能需要使用酒精。酒精透化也可增強磷酸化特異抗體的磷酸化蛋白檢測，因酒精具有變性的特點。

質譜

復雜的生物樣品(如細胞裂解液)中蛋白質磷酸化的全面評估(磷酸化蛋白質組學)對于了解基于磷酸化的信號網(wǎng)絡很重要。復雜的蛋白混合物中大規(guī)模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鑒定，以及磷酸化殘基的測序。質譜(MS)技術是完成這些任務的有用工具。盡管質譜在鑒定單個蛋白上具有出色的靈敏度和分辨率，但對于磷酸化蛋白的分析，還有一些固有的困難。首先，磷酸化肽段的信號通常較弱，因為它們帶負電荷，而電噴霧質譜在正電模式下作用，因此電離效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很難觀察到低豐度目的蛋白的信號。為了克服這些缺點，人們已經(jīng)開發(fā)出一些富集策略，包括固定化金屬親和層析(IMAC)、磷酸化特異抗體富集、化學修飾法(如磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的β-消去反應)，以及用生物素化的基團取代磷酸基團。

多個分析物圖譜分析

質譜技術如碰撞誘導解離(CID)和電子轉移解離(ETD)，提供了肽段序列和翻譯后修飾(磷酸化)的全面平行分析。這些技術相當費力，而當特定通路作為主要研究目標時，可能不需要全面的磷酸化分析策略。這導致一些同時測定多個分析物的蛋白磷酸化的新方法被開發(fā)出來?？偟膩碚f，這些方法涉及到磷酸化特異抗體的使用，包括基于微孔板、磁珠和膜，基于磁珠和基于膜的檢測形式。這些分析zui明顯的好處在于通量能力被大大提高，避免了運行多個Western blot或傳統(tǒng)的ELISA分析的需要。這些技術也能夠提供更多的數(shù)據(jù)，而所需的樣品量極少。相應地，蛋白圖譜分析通常被認為靈敏度不及傳統(tǒng)的對應技術，因潛在的抗體交叉反應性。